Javascript è attualmente disabilitato nel tuo browser.Diverse funzionalità di questo sito non funzioneranno mentre javascript è disabilitato.accesso aperto alla ricerca scientifica e medicaDalla presentazione alla prima decisione editoriale.Dall'accettazione editoriale alla pubblicazione.La suddetta percentuale di manoscritti è stata respinta negli ultimi 12 mesi.Riviste scientifiche e mediche peer-reviewed ad accesso libero.Dove Medical Press è membro dell'OAI.Ristampe in blocco per l'industria farmaceutica.Offriamo vantaggi reali ai nostri autori, inclusa l'elaborazione accelerata degli articoli.Registra i tuoi dettagli specifici e farmaci specifici di interesse e abbineremo le informazioni fornite agli articoli dal nostro ampio database e ti invieremo prontamente copie PDF via e-mail.Torna a Diari » Progettazione, sviluppo e terapia di farmaci » Volume 16Autori Zhao T, Wang X, Liu Q, Yang T, Qu H, Zhou HPubblicato il 22 agosto 2022 Volume 2022:16 Pagine 2767—2782DOI https://doi.org/10.2147/DDDT.S377624Revisione tramite revisione tra pari anonima singolaEditore che ha approvato la pubblicazione: Dr Anastasios LymperopoulosTingyao Zhao,1,* Xinting Wang,2,* Qian Liu,2 Tianshu Yang,1 Huiyan Qu,1 Hua Zhou2 1Dipartimento di malattie cardiovascolari, ospedale di Shuguang affiliato all'Università di medicina tradizionale cinese di Shanghai, Shanghai, Repubblica popolare cinese;2Institute of Cardiovascular Disease of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Shuguang Hospital Affiliato all'Università di Medicina Tradizionale Cinese di Shanghai, Shanghai, Repubblica Popolare Cinese *Questi autori hanno contribuito in egual modo a questo lavoro Corrispondenza: Hua Zhou;Huiyan Qu, ospedale di Shuguang affiliato all'Università di medicina tradizionale cinese di Shanghai, n. 528, Zhangheng Road, Pudong New Area, Shanghai, 201203, Repubblica popolare cinese, e-mail [e-mail protetta];[email protected] Abstract: Scopo: Questo studio mirava a chiarire i potenziali meccanismi molecolari mediante i quali GSRd migliora l'infiammazione cardiaca e l'ambiente immunitario dopo un infarto miocardico.Materiali e metodi: i potenziali geni bersaglio di GSRd sono stati previsti utilizzando il database STITCH.In vivo, i modelli di topi MI sono stati stabiliti mediante legatura discendente anteriore sinistra e sono stati divisi nel gruppo sham, gruppo MI + veicolo e gruppo MI + GSRd.DMSO, DMSO e GSRd 50 μL/die sono stati rispettivamente iniettati per via intraperitoneale.Dopo 28 giorni, sono state eseguite ecocardiografia, colorazione Masson, colorazione con immunofluorescenza, citometria a flusso, RT-PCR e Western blot.I macrofagi peritoneali dei topi sono stati estratti in vitro e il Western blot è stato eseguito dopo l'intervento dell'inibitore di GSRd e/o Akt MK2206.Risultati: GSRd ha migliorato significativamente la funzione miocardica del topo, ha attenuato la fibrosi cardiaca e ha inibito l'infiammazione e l'apoptosi nei tessuti del miocardio dopo un infarto del miocardio.Nel frattempo, GSRd ha aumentato Ly6Clow Mos/Mps non classico mentre riduceva Ly6Chigh Mos/Mps classico allo stesso tempo nei tessuti del miocardio.Inoltre, GSRd ha invertito significativamente l'attività di p-Akt e p-mTOR nel cuore Mos/Mps dopo MI.Studi in vitro hanno mostrato che l'attività di p-Akt e p-mTOR nei macrofagi peritoneali era significativamente aumentata in modo dose-dipendente dopo il trattamento con GSRd.Inoltre, è stato scoperto che l'inibitore dell'AKT MK2206 blocca l'attività potenziata di p-Akt e p-mTOR indotta da GSRd nei macrofagi peritoneali.Conclusione: GSRd può migliorare la trasformazione di Ly6Chigh Mos/Mps in Ly6Clow Mos/Mps nei topi dopo MI attivando la via di segnalazione Akt/mTOR, inibendo la disfunzione cardiaca e promuovendo la riparazione cardiaca.Parole chiave: infarto miocardico, ginsenoside rd, monociti/macrofagi, Akt/mTORL'infarto miocardico acuto (IM) è una delle principali cause di morte nella malattia coronarica e la sua incidenza ha mostrato una tendenza al miglioramento negli ultimi anni.1,2 Nei mammiferi adulti, la limitata capacità rigenerativa del miocardio dopo l'infarto del miocardio non può compensare un gran numero di cardiomiociti necrotici mentre i cardiomiociti persi vengono sostituiti da fibroblasti proliferanti e secernono matrice extracellulare disregolata, portando a rimodellamento ventricolare, aritmie, insufficienza cardiaca ed eventi potenzialmente letali.3 Pertanto, come inibire il rimodellamento ventricolare dopo un infarto del miocardio, ridurre l'area dell'infarto miocardico e ritardare l'insorgenza di insufficienza cardiaca è un mezzo efficace per migliorare l'effetto del trattamento clinico e la qualità di vita dei pazienti.Dopo l'IM, i monociti/macrofagi (Mos/Mps) vengono reclutati nel cuore per svolgere ruoli chiave come attori infiammatori e regolatori centrali del rimodellamento ventricolare.4,5 Due diverse sottopopolazioni Mos/Mps, tra cui Ly6Chigh e Ly6Clow, hanno partecipato al rimodellamento ventricolare dopo infarto del miocardio in periodi diversi.6,7 Durante 1-3 giorni dopo l'infarto del miocardio Mos/Mps reattivi precoci (Ly6Chigh) esercitano effetti fagocitici e proinfiammatori secernendo massicciamente l'interleuchina-6 (IL-6), il fattore di necrosi tumorale-α (TNF -α), mieloperossidasi e catepsina nel tessuto miocardico.8 E durante 4-7 giorni dopo l'infarto del miocardio, Mos/Mps a risposta tardiva (Ly6Clow) svolge un ruolo antinfiammatorio e promuove la riparazione cardiaca secernendo citochine di riparazione, incluso il fattore di crescita trasformante- β1 (TGF-β1), interleuchina-10 (IL-10) e fattore di crescita dell'endotelio vascolare (VEGF).7 Inoltre, Ly6Chigh Mos può essere convertito in Ly6Clow Mos in circolazione9,10 e tessuti infiammati, compresi gli infarticuori.8,11 Le conversioni ritardate di Ly6Chigh in Ly6Clow Mos/Mps possono attenuare la riparazione della ferita dopo un infarto del miocardio, come negli animali con aterosclerosi, diabete o infarto del miocardio.7,12,13 Pertanto, la maggiore trasformazione di Ly6Chigh Mos/Mps in Ly6Clow Mos/Mps può aiutare a rallentare il rimodellamento ventricolare dopo un infarto miocardico e ritardare lo sviluppo dell'insufficienza cardiaca.La Medicina Tradizionale Cinese (MTC) ha una lunga storia e una notevole efficacia nella prevenzione e nel trattamento dell'IM.La patogenesi dell'IM è la carenza di Qi cardiaco e l'incapacità di stimolare il flusso sanguigno, quindi la stasi del sangue, con conseguente necrosi ischemica del miocardio causata da un'occlusione transitoria o persistente dell'arteria coronaria distale.Il ginseng è una delle erbe medicinali naturali più preziose in Cina e nel mondo ed è un'erba cruciale per il trattamento dell'MI.14 I ginsenosidi hanno effetti farmacologici e terapeutici sul sistema immunitario,15 cardiovascolare,16,17 endocrino,18 e nervoso.19 Ginsenoside Rd (GSRd) è identificato come uno dei principi attivi più importanti del Ginseng e ha effetti antinfiammatori sui componenti immunitari naturali.20 GSRd ha un'ampia gamma di applicazioni nella ricerca sulle malattie ischemiche.GSRd ha attivato la via di segnalazione Akt/GSK-3beta, ha aumentato il rapporto Bcl-2/Bax, ha inibito la via apoptotica mitocondriale-dipendente per attenuare il danno da ischemia-riperfusione miocardica nei ratti e ha ridotto le dimensioni dell'infarto.21 GSRd migliora l'attività dell'enzima antiossidante, stabilizza potenziale della membrana mitocondriale, aumenta i livelli di ATP intracellulare e attiva la via di segnalazione PI3K/Akt per promuovere la sopravvivenza neuronale e migliora il danno cerebrale ischemico.22 GSRd protegge dal danno da ischemia/riperfusione renale inibendo la polarizzazione del macrofago M123 e attenua la neurite autoimmune sperimentale nei topi mediante regolazione della conversione di sottoinsiemi di monociti.24 Tuttavia, il ruolo di GSRd nella trasformazione fenotipica Mos/Mop dopo infarto del miocardio e il suo meccanismo molecolare rimangono poco chiari.In questo studio, abbiamo stabilito il modello murino di infarto miocardico per valutare l'effetto terapeutico di GSRd sulla fibrosi e sulla funzione cardiaca dopo infarto miocardico acuto ed esplorare il suo potenziale meccanismo, fornendo una nuova scelta e una base teorica per la prevenzione e il trattamento del rimodellamento ventricolare dopo infarto miocardico.Gli standard di Ginsenoside Rd (Selleck, Houston, USA) (purezza > 95%) sono stati sciolti in dimetilsolfossido (DMSO) per ottenere una soluzione madre per ulteriori indagini.Topi maschi C57BL/6J di otto settimane (22–25 g) sono stati acquistati da SLAC Laboratory Animal Co., Ltd. (Shanghai, Cina) e alloggiati in un ambiente a temperatura controllata (22°C ± 1°C) e umidità relativa (50% ± 5%) su un ciclo luce/buio di 12 ore:12 ore, con libero accesso a cibo e acqua sterili.I topi sono stati divisi casualmente in tre gruppi: (a) gruppo sham, (b) gruppo MI + veicolo e (c) gruppo MI + GSRd.I topi nei gruppi sham e MI sono stati iniettati per via intraperitoneale con DMSO del veicolo, 50 μL/giorno.I topi nel gruppo GSRd hanno ricevuto un'iniezione intraperitoneale di GSRd, 50 μL/giorno (GSRd disciolto in DMSO, 50 μg/kg/giorno).Tutte le procedure in questo studio sono state approvate dal Comitato sperimentale per il benessere degli animali e l'etica dell'Università di medicina tradizionale cinese di Shanghai (NO. PZSHUTCM210226013).Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti seguendo le linee guida sperimentali sugli animali stabilite dalla National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.I topi maschi di età compresa tra 6 e 8 settimane sono stati sottoposti a legatura permanente dell'arteria coronaria del ramo discendente anteriore sinistro (LAD).25 In breve, i topi sono stati anestetizzati con gas isoflurano all'1–1,5% e ventilati meccanicamente con respiratori per roditori.La toracotomia sinistra è stata eseguita per aprire la cavità toracica ed esporre il cuore in modo che il LAD potesse essere visto e legato in modo permanente con filo di seta 6-0 all'esterno dell'atrio sinistro.La presenza di rami miocardici nel letto di perfusione ha confermato la completa occlusione vascolare.I topi morti entro 24 ore dall'intervento chirurgico sono stati esclusi dall'esperimento.Gli animali fittizi sono stati sottoposti alla stessa procedura, ma senza legatura coronarica.L'ecocardiografia transtoracica è stata eseguita per valutare la funzione cardiaca del topo dopo l'intervento chirurgico utilizzando un ecocardiografo (Vevo2100, Visual Sonics, USA) con analisi M-mode.Tutti i topi (8-10 settimane) sono stati anestetizzati mediante inalazione di isoflurano (1%-2%).Come descritto in precedenza,26 il lobo della valvola mitrale è stato visualizzato in una vista parasternale dell'asse lungo per valutare la funzione cardiaca.Le criosezioni del cuore (7μm) sono state preparate e colorate con l'anticorpo monoclonale CD68 (FA-11) (1:200, eBioscience, USA) durante la notte a 4 ° C.Successivamente, le sezioni sono state incubate con anticorpi secondari congettati con Alexa Fluor 488 per 1 ora al buio.I nuclei sono stati colorati con DAPI (1:2000, Thermo Fisher, USA).Tutti i vetrini sono stati montati con ProLongTM Gold (Thermo Fisher, USA).Il microscopio confocale di Zeiss è stato utilizzato per acquisire immagini.Il software Image J è stato applicato per analizzare le immagini ottenute.L'RNA è stato isolato dalle cellule utilizzando TRIzol (Invitrogen, USA) e 1μg di RNA è stato utilizzato come modello per la sintesi di cDNA utilizzando kit di trascrizione inversa (Takara, Dalian, Cina), quindi il cDNA è stato sottoposto all'analisi PCR in tempo reale utilizzando una miscela verde TB (Takara, Dalian, Cina) su un sistema ABI 7900 Q-PCR di Life Technologies (Carlsbad, CA, USA) secondo il protocollo del produttore.Tutti i livelli di espressione dell'mRNA sono stati normalizzati confrontandoli con il gene housekeeping GAPDH.Le sequenze di primer per l'analisi PCR in tempo reale di campioni di topi sono state verificate rispetto al database del National Center for Biotechnology Information per confermare la specificità e sono elencate nella Tabella 1.Tabella 1 Sequenza per RT-PCR PrimerTabella 1 Sequenza per RT-PCR PrimerI campioni di cuore sono stati raccolti e fissati in formalina tamponata con fosfato al 10% per 24 ore, successivamente incorporati in paraffina e tagliati in fette da 5 μm.Sezioni istologiche di tessuti sono state colorate con il tricromo di Masson (Solaribio, Pechino, Cina).L'area della sezione trasversale media e la fibrosi dell'apice ventricolare sinistro fino al punto di attacco del lembo della valvola aortica sono state valutate dal software Image-Pro Plus.I macrofagi peritoneali sono stati ottenuti dalla cavità addominale e coltivati ​​in terreno 1640 contenente il 10% di siero bovino fetale.Sono state preparate sospensioni unicellulari di cuori infartuati.In breve, il cuore è stato sezionato, tritato con delicate forbici e digerito enzimaticamente con un digerito con una miscela di collagenasi (tra cui 125 U/ml di collagenasi IX, 450 U/ml di collagenasi I, 60 U/ml di DNasi I e 60/U ml ialuronidasi IS (Sigma -Aldrich, St Louis, MO, USA) per 1 ora a 37 ° C con leggera agitazione.Dopo la digestione, i tessuti sono stati triturati, passati attraverso filtri cellulari da 70 mm, lavati, lisati globuli rossi e colorati con anticorpi per l'analisi di ordinamento cellulare attivato a fluorescenza (FACS) Per l'ordinamento di monociti/macrofagi, le cellule sono state quindi colorate con APC-Cy7-CD11b (M1/70, 1:50, BD, USA), - CD115 (CSF-1R, 1 :50, BioLegend, USA), FITC-Ly6C (HK1.4, 1:50, BioLegend) e Brilliant Violet 421-Ly6G (1A8, 1:50, BD, USA).Sistema di citometria a flusso BD FACS Aria (BD Biosciences) , San Jose, CA, USA) è stato utilizzato per eseguire la citometria a flusso e il software FlowJo (Tree Star, Ashland, OR, USA) è stato utilizzato per analizzare i dati della citometria a flusso. Per monociti/macrofagi ordinati, è stata eseguita la RT-PCR.Le cellule sono state raccolte da topi e colorate con anticorpi marcati con fluorescenza secondo il protocollo del produttore.Tutti gli anticorpi coniugati con fluorocromi come segue: APC-Cy7-CD11b (M1/70, 1:50, BD, USA), - CD115 (CSF-1R, 1:50, BioLegend, USA), FITC-Ly6C (HK1.4 , 1:50, BioLegend) e Brilliant Violet 421-Ly6G (1A8, 1:50, BD, USA).Il sistema di citometria a flusso BD FACS Aria (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) è stato utilizzato per eseguire la citometria a flusso e il software FlowJo (Tree Star, Ashland, OR, USA) è stato utilizzato per analizzare i dati di citometria a flusso.I tessuti e le cellule del cuore sono stati estratti in tampone di lisi contenente inibitori della proteasi.Pierce BCA Protein Assay Kit (Pierce, Rockford, IL, USA) è stato utilizzato per valutare la concentrazione di proteine.Uguali quantità di proteine ​​sono state denaturate, sciolte in gel SDS-PAGE al 10%, trasferite su una membrana di nitrocellulosa, incubate con latte scremato al 5% per 1–1,5 h e quindi incubate con anticorpo primario a 4°C per una notte.Gli anticorpi primari sono stati diluiti come segue: proteina chemioattrattiva-1 (Mcp-1) (1:1000, Proteintech, USA), recettore 2 delle chemochine con motivo CC (CCR2) (1:500, Abcam, Regno Unito), p-AKT (1: 1000, CST, USA), AKT (1:1000, CST, USA), p-mTOR (1:1000, CST, USA), mTOR (1:1000, CST, USA), Bax (1:1000, ABclonal, USA), Bcl-1 (1:1000, ABclonal, USA) e GAPDH (1:2000, CST, USA), utilizzati come controllo del carico.Le membrane sono state quindi incubate a temperatura ambiente in un tampone bloccante contenente un anticorpo secondario marcato con HRP per 2 ore a temperatura ambiente.Il reagente a chemiluminescenza potenziata (Thermo Fisher Scientific, USA) è stato utilizzato per sviluppare western blot.L'analisi dei dati è stata ottenuta da GraphPad Prism versione 5.0 (GraphPad Software, Inc.).I risultati sono mostrati come media ± errore standard della media (SEM).Il confronto tra i gruppi è stato eseguito utilizzando il test t di Student a due code e l'analisi della varianza a una o due vie con le analisi post-hoc di Bonferroni.p < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.Secondo la letteratura,27 nell'esperimento è stata progettata una dimensione statistica sufficiente del campione.Quando possibile, sono state utilizzate strategie di randomizzazione e accecamento.Per esplorare l'effetto di GSRd (Figura 1A) sulla funzione contrattile cardiaca in vivo, i topi WT sono stati iniettati con veicolo DMSO o GSRd (50 μg/kg di peso corporeo) e sono stati sottoposti a un intervento chirurgico di legatura dell'arteria fittizia o LAD per 4 settimane (Figura 1B).La sopravvivenza dei topi è stata osservata dopo 4 settimane (Figura 1C).Nessun topo nel gruppo sham è morto, il 55% dei topi nel gruppo MI + veicolo è morto e il 30% dei topi MI trattati con GSRd è morto.La sopravvivenza è stata significativamente ridotta nel gruppo MI + veicolo rispetto al gruppo sham;GSRd ha migliorato significativamente la sopravvivenza rispetto al gruppo MI + veicolo.L'intervento di GSRd ha migliorato significativamente la sopravvivenza dei topi con infarto miocardico.Figura 1 Effetti di GSRd sulla disfunzione cardiaca in seguito a infarto miocardico.(A) Informazioni sulla formula della struttura di GSRd.n = 20 per gruppo.(B) Protocolli sperimentali per il trattamento di MI e GSRd.(C) Cambiamenti nei tassi di sopravvivenza dei topi dopo MI (n = 20).(D) Effetti di GSRd sulle immagini ecocardiografiche.(E) frazione di eiezione cardiaca (n = 6), (F) frazione di accorciamento (n = 6).*P < 0,05 rispetto al gruppo fittizio;#P < 0,05 rispetto a MI + gruppo di veicoli.Figura 1 Effetti di GSRd sulla disfunzione cardiaca in seguito a infarto miocardico.(A) Informazioni sulla formula della struttura di GSRd.n = 20 per gruppo.(B) Protocolli sperimentali per il trattamento di MI e GSRd.(C) Cambiamenti nei tassi di sopravvivenza dei topi dopo MI (n = 20).(D) Effetti di GSRd sulle immagini ecocardiografiche.(E) frazione di eiezione cardiaca (n = 6), (F) frazione di accorciamento (n = 6).*P < 0,05 rispetto al gruppo fittizio;#P < 0,05 rispetto a MI + gruppo di veicoli.Inoltre, un sistema di imaging ecocardiografico ad alta risoluzione con analisi del modello M ha rivelato che la frazione di eiezione e l'accorciamento frazionario erano significativamente ridotti nei topi del gruppo MI + veicolo rispetto al gruppo sham e i topi trattati con GSRd hanno mostrato un aumento significativo della frazione di eiezione e dell'accorciamento frazionario dopo MI rispetto al gruppo di veicoli MI + (Figura 1D-F).Questi risultati hanno indicato che la modellazione di topi modello MI ha avuto successo e GSRd potrebbe migliorare la funzione cardiaca dei topi dopo MI.Per esplorare se GSRd colpisce la fibrosi cardiaca dopo MI, è stata eseguita la colorazione tricromica di Masson (Figura 2A).Come mostrato nelle Figure 2B e C, la zona dell'infarto e l'area della fibrosi della zona di confine dei topi del gruppo MI + veicolo sono aumentate in modo significativo rispetto al gruppo fittizio.Rispetto ai topi MI non trattati, i topi MI trattati con GSRd hanno ridotto significativamente la zona dell'infarto e l'area della fibrosi della zona di confine.I livelli di mRNA dei marcatori di fibrosi miocardica (fattore di crescita del tessuto connettivo (CTGF), collagene Iα1, collagene IIIα1 e fibronectina (Fn)) nei tessuti cardiaci con la zona dell'infarto sono stati misurati in ciascun gruppo, come mostrato nella Figura 2D.Rispetto al gruppo sham, i livelli di mRNA della zona dell'infarto cardiaco di CTGF, collagene Iα1, collagene IIIα1 e Fn erano significativamente aumentati nei topi del gruppo MI + veicolo.I topi MI trattati con GSRd hanno ridotto significativamente i livelli di mRNA di CTGF, collagene Iα1, collagene IIIα1 e Fn della zona dell'infarto cardiaco rispetto ai topi MI non trattati.Questi dati suggeriscono che la terapia con GSRd inibisce la fibrosi miocardica dopo infarto miocardico e allevia il rimodellamento cardiaco.Figura 2 Effetti di GSRd sulla fibrosi cardiaca dopo infarto miocardico.(A) Colorazione tricromica di Masson delle sezioni istologiche a 4 settimane dopo MI.Barra della scala = 100μm.(B) Protocolli sperimentali per il trattamento di MI e GSRd.(C) Percentuale di sopravvivenza.(D) Analisi di reazione a catena della polimerasi quantitativa a trascrizione inversa di CTGF, Collagene I α1, Collagene III α1 e fibronectina 1 (n = 6).*P < 0,05 rispetto al gruppo fittizio;#P < 0,05 rispetto a MI + gruppo di veicoli.Figura 2 Effetti di GSRd sulla fibrosi cardiaca dopo infarto miocardico.(A) Colorazione tricromica di Masson delle sezioni istologiche a 4 settimane dopo MI.Barra della scala = 100μm.(B) Protocolli sperimentali per il trattamento di MI e GSRd.(C) Percentuale di sopravvivenza.(D) Analisi di reazione a catena della polimerasi quantitativa a trascrizione inversa di CTGF, Collagene I α1, Collagene III α1 e fibronectina 1 (n = 6).*P < 0,05 rispetto al gruppo fittizio;#P < 0,05 rispetto a MI + gruppo di veicoli.Come mostrato nelle Figure 3A e B, i macrofagi nel tessuto miocardico sono stati contrassegnati dalla colorazione immunoistochimica CD68.Rispetto al gruppo sham, l'infiltrazione dei macrofagi cardiaci nel gruppo MI + veicolo era significativamente aumentata.GSRd ha ridotto significativamente l'infiltrazione dei macrofagi cardiaci dopo MI rispetto al gruppo MI + veicolo.Figura 3 Effetti di GSRd sull'infiltrazione dei macrofagi cardiaci e sui tessuti infiammatori a seguito di infarto miocardico.(A) Immagini immunofluorescenti rappresentative di CD68 nei tessuti del cuore.Barra della scala, 50μm.(B) Quantificazione dell'area CD68+ per campo in (A), n=3-5 per gruppo.(C) Espressione proteica Mcp-1 e CCR2 nel tessuto cardiaco di ciascun gruppo di topi rilevati da Western blot.(D) Espressione proteica relativa Mcp-1 e CCR2 rispetto a GAPDH.(E) Espressione proteica Bax e Bcl-2 nel tessuto cardiaco di ciascun gruppo di topi rilevati da Western blot.(F) Bax e Bcl-2 relativa espressione proteica a GAPDH.(G) Analisi di reazione a catena della polimerasi quantitativa a trascrizione inversa di TNFα, IL-1β e IL-6 (n = 6) nel tessuto cardiaco di ciascun gruppo di topi.*P < 0,05 rispetto al gruppo fittizio;#P < 0,05 rispetto a MI + gruppo di veicoli.Figura 3 Effetti di GSRd sull'infiltrazione dei macrofagi cardiaci e sui tessuti infiammatori a seguito di infarto miocardico.(A) Immagini immunofluorescenti rappresentative di CD68 nei tessuti del cuore.Barra della scala, 50μm.(B) Quantificazione dell'area CD68+ per campo in (A), n=3-5 per gruppo.(C) Espressione proteica Mcp-1 e CCR2 nel tessuto cardiaco di ciascun gruppo di topi rilevati da Western blot.(D) Espressione proteica relativa Mcp-1 e CCR2 rispetto a GAPDH.(E) Espressione proteica Bax e Bcl-2 nel tessuto cardiaco di ciascun gruppo di topi rilevati da Western blot.(F) Bax e Bcl-2 relativa espressione proteica a GAPDH.(G) Analisi di reazione a catena della polimerasi quantitativa a trascrizione inversa di TNFα, IL-1β e IL-6 (n = 6) nel tessuto cardiaco di ciascun gruppo di topi.*P < 0,05 rispetto al gruppo fittizio;#P < 0,05 rispetto a MI + gruppo di veicoli.I monociti pro-infiammatori Ly6Chigh si basano su Mcp-1/CCR2 per raggiungere il sito infiammatorio dell'IM.Come mostrato nelle Figure 3C e D, l'analisi Western blot è stata utilizzata per rilevare l'effetto di GSRd sull'espressione della proteina Mcp-1/CCR2 nel tessuto cardiaco con infarto miocardico.Rispetto al gruppo sham, l'espressione della proteina Mcp-1/CCR2 era significativamente sovraregolata nel gruppo del veicolo MI +.L'espressione della proteina Mcp-1/CCR2 era significativamente sottoregolata dopo il trattamento con GSRd rispetto al gruppo MI + veicolo.Come mostrato nelle Figure 3E e F, l'analisi Western blot è stata utilizzata per rilevare l'effetto di GSRd sulla proteina correlata all'apoptosi Bcl-2/Bax dei cardiomiociti di topi MI.Bcl-2 era una proteina anti-apoptotica e Bax era una proteina pro-apoptotica.Rispetto al gruppo sham, l'espressione della proteina Bcl-2 era significativamente sottoregolata e l'espressione della proteina Bax era significativamente sovraregolata nel gruppo MI + veicolo.Rispetto al gruppo veicolo MI +, l'espressione della proteina Bcl-2 era significativamente sovraregolata e l'espressione della proteina Bax era significativamente sottoregolata dopo il trattamento con GSRd.Come mostrato nella Figura 3G, i livelli di espressione di mRNA dei mediatori pro-infiammatori TNF-α, IL-1β e IL-6 nel tessuto cardiaco MI sono stati rilevati mediante RT-PCR.Rispetto al gruppo sham, i livelli di espressione dell'mRNA dei mediatori pro-infiammatori TNF-α, IL-1β e IL-6 nel gruppo MI + veicolo erano significativamente aumentati.Rispetto al gruppo veicolo MI +, i livelli di espressione dell'mRNA di TNF-α, IL-1β e IL-6 sono diminuiti considerevolmente dopo il trattamento con GSRd.Questi risultati indicano che GSRd inibisce l'infiammazione e l'apoptosi nei tessuti del miocardio.Mos/Mps circolanti hanno l'importante caratteristica di essere reclutati in siti infiammatori e sottoinsiemi di fenotipi diversi mostrano funzioni diverse.Ad esempio, i macrofagi differenziati dai monociti possono ricostituire il pool di macrofagi tissutali e modulare l'ambiente infiammatorio locale con conseguente danno cardiaco.Al fine di studiare l'effetto di GSRd sulla trasformazione in situ di Ly6Chigh - Ly6Clow Mos/Mps, il tessuto cardiaco del topo è stato raccolto immediatamente per l'analisi della citometria a flusso e l'analisi quantitativa RT-PCR dopo il sacrificio.Come mostrato nella Figura 4A-D, l'infiltrazione cardiaca totale Mos/Mps e Ly6Chigh Mos/Mps è aumentata significativamente nel gruppo MI + veicolo rispetto al gruppo sham.Al contrario, l'infiltrazione cardiaca Ly6Clow Mos/Mps è diminuita significativamente.Rispetto al gruppo MI + veicolo, GSRd ha ridotto significativamente l'infiltrazione cardiaca totale Mos/Mps e Ly6Chigh Mos/Mps dopo MI e aumentato significativamente l'infiltrazione cardiaca di Ly6Clow Mos/Mps.Figura 4 Effetti di GSRd sulla modulazione della conversione di sottoinsiemi Mos/Mps dopo MI.(A) Strategia di gating per CD11b+CD115+Ly6G- Ly6Chigh e CD11b+CD115+Ly6G-Ly6Clow Mos/Mps nei cuori di ciascun gruppo di topi.(BD) Mos/Mps totali (B), Ly6Chigh (C) e Ly6Clow (D) Mos/Mps nei cuori di ciascun gruppo di topi.(E e F) Analisi della reazione a catena della polimerasi quantitativa a trascrizione inversa dei marcatori antinfiammatori (E) e dei marcatori pro-infiammatori (F) nel Mos/Mps infiltrante (n=6).*P < 0,05 rispetto al gruppo fittizio;#P < 0,05 rispetto a MI + gruppo di veicoli.Figura 4 Effetti di GSRd sulla modulazione della conversione di sottoinsiemi Mos/Mps dopo MI.(A) Strategia di gating per CD11b+CD115+Ly6G- Ly6Chigh e CD11b+CD115+Ly6G-Ly6Clow Mos/Mps nei cuori di ciascun gruppo di topi.(BD) Mos/Mps totali (B), Ly6Chigh (C) e Ly6Clow (D) Mos/Mps nei cuori di ciascun gruppo di topi.(E e F) Analisi della reazione a catena della polimerasi quantitativa a trascrizione inversa dei marcatori antinfiammatori (E) e dei marcatori pro-infiammatori (F) nel Mos/Mps infiltrante (n=6).*P < 0,05 rispetto al gruppo fittizio;#P < 0,05 rispetto a MI + gruppo di veicoli.Come mostrato nelle Figure 4E e F, le espressioni di mRNA delle citochine correlate alla riparazione e pro-angiogenica (IL-13, TGFβ1, VEGF e MMP9) e alle citochine correlate alla pro-infiammatoria (IL-1β, IL-12 e TNFα) in i Mos/Mps infiltranti sono stati rilevati mediante RT-PCR.Rispetto al gruppo sham, le espressioni dell'mRNA delle citochine correlate alla riparazione e all'angiogenicità (IL-13, TGFβ1, VEGF e MMP9) erano significativamente sottoregolate nel gruppo del veicolo MI + e le espressioni dell'mRNA delle citochine correlate al pro-infiammatorio le citochine (IL-1β e TNFa) erano significativamente sovraregolate.Rispetto al gruppo veicolo MI +, le espressioni di mRNA di citochine correlate riparabili e pro-angiogeniche (IL-13, TGFβ1, VEGF e MMP9) erano significativamente sovraregolate dopo il trattamento con GSRd, mentre le espressioni di mRNA di citochine correlate pro-infiammatorie non sono stati colpiti in modo significativo.Presi insieme, questi risultati suggeriscono che GSRd promuove il reclutamento di Ly6Clow Mos/Mps nel cuore dopo MI.I potenziali geni bersaglio di GSRd sono stati previsti utilizzando STITCH (//stitch.embl.de/),28 che ha identificato AKT1, CYCS e TRPM7 che interagiscono direttamente con GSRd (Figura 5A).È interessante notare che mTOR, come molecola a valle di PI3K/Akt attivata dai recettori Toll-like, è stato precedentemente segnalato come critico nella coordinazione immunitaria innata di macrofagi e monociti.29,30La figura 5 GSRd modula la conversione dei sottoinsiemi Mos/Mps dopo MI tramite il percorso AKT/mTOR.(A) Il potenziale gene target di GSRd è stato previsto dallo STITCH.(B) espressione proteica total-Akt, p-Akt, total-mTOR e p-mTOR in Mos/Mps raccolti dal tessuto cardiaco di ciascun gruppo di topi rilevati da Western blot.(C) espressione proteica total-Akt, p-Akt, total-mTOR e p-mTOR nell'espressione proteica relativa Mos/Mps rispetto a GAPDH.*P < 0,05 rispetto al gruppo fittizio;#P < 0,05 rispetto a MI + gruppo di veicoli.La figura 5 GSRd modula la conversione dei sottoinsiemi Mos/Mps dopo MI tramite il percorso AKT/mTOR.(A) Il potenziale gene target di GSRd è stato previsto dallo STITCH.(B) espressione proteica total-Akt, p-Akt, total-mTOR e p-mTOR in Mos/Mps raccolti dal tessuto cardiaco di ciascun gruppo di topi rilevati da Western blot.(C) espressione proteica total-Akt, p-Akt, total-mTOR e p-mTOR nell'espressione proteica relativa Mos/Mps rispetto a GAPDH.*P < 0,05 rispetto al gruppo fittizio;#P < 0,05 rispetto a MI + gruppo di veicoli.Come mostrato nelle Figure 5B e C, abbiamo esaminato l'attività del percorso Akt/mTOR in Mos/Mps nel cuore di ciascun gruppo tramite l'analisi western blot.Rispetto al gruppo sham, l'attività p-Akt e p-mTOR erano significativamente diminuite nel gruppo MI + veicolo.Rispetto al gruppo di veicoli MI +, l'attività di p-Akt e p-mTOR è aumentata dopo il trattamento con GSRd.Gsrd regola la conversione dei sottoinsiemi Mos/Mps cardiaci dopo MI e il possibile meccanismo è quello di attivare l'attività della via Akt/mTOR.Per chiarire ulteriormente l'effetto di GSRd sull'attività del percorso Akt/mTOR nei macrofagi, i macrofagi peritoneali di topo sono stati estratti e trattati con l'inibitore di attivazione di AKT MK2206.Come mostrato nelle Figure 6A e B, rispetto al gruppo di controllo in bianco, GSRd a concentrazioni di 20μM e 50μM ha aumentato significativamente l'attività della via Akt/mTOR nei macrofagi peritoneali, specialmente a concentrazioni di 50μM.Questo esperimento dose-effetto ha suggerito che l'attività della via Akt/mTOR nei macrofagi peritoneali dipendesse dalla concentrazione di GSRd.La Figura 6 GSRd regola l'attività Akt/mTOR dei macrofagi peritoneali.(A) Espressione proteica total-Akt, p-Akt, total-mTOR e p-mTOR nel macrofago peritoneale con GSRd trattato rilevato da Western blot.(B) espressione proteica total-Akt, p-Akt, total-mTOR e p-mTOR nell'espressione proteica relativa dei macrofagi peritoneali rispetto a GAPDH.(C) espressione della proteina total-Akt, p-Akt, total-mTOR e p-mTOR nel macrofago peritoneale con MK2206 e/o GSRd trattati con Western blot.Ginsenoside Road;infarto miocardico;MK2206, un inibitore dell'AKT.(D) espressione proteica total-Akt, p-Akt, total-mTOR e p-mTOR nel macrofago peritoneale con espressione proteica relativa MK2206 e/o GSRd rispetto a GAPDH.*P < 0,05 rispetto al gruppo fittizio;#P < 0,05 rispetto a MI + gruppo di veicoli.La Figura 6 GSRd regola l'attività Akt/mTOR dei macrofagi peritoneali.(A) Espressione proteica total-Akt, p-Akt, total-mTOR e p-mTOR nel macrofago peritoneale con GSRd trattato rilevato da Western blot.(B) espressione proteica total-Akt, p-Akt, total-mTOR e p-mTOR nell'espressione proteica relativa dei macrofagi peritoneali rispetto a GAPDH.(C) espressione della proteina total-Akt, p-Akt, total-mTOR e p-mTOR nel macrofago peritoneale con MK2206 e/o GSRd trattati con Western blot.Ginsenoside Road;infarto miocardico;MK2206, un inibitore dell'AKT.(D) espressione proteica total-Akt, p-Akt, total-mTOR e p-mTOR nel macrofago peritoneale con espressione proteica relativa MK2206 e/o GSRd rispetto a GAPDH.*P < 0,05 rispetto al gruppo fittizio;#P < 0,05 rispetto a MI + gruppo di veicoli.Come mostrato nelle Figure 6C e D, l'inibitore di attivazione di Akt MK2206 è stato utilizzato per verificare ulteriormente l'attività del percorso Akt/mTOR dei macrofagi peritoneali GSRd.Rispetto al gruppo di controllo in bianco, GSRd(50μM) ha aumentato significativamente l'attività del percorso Akt/mTOR, MK2206(5.5nM) ha ridotto significativamente l'attività del percorso Akt/mTOR, GSRd(50μM) combinato con MK2206(5.5nM) ha ridotto significativamente il attività della via Akt/mTOR nei macrofagi peritoneali.L'attività della via Akt/mTOR è stata aumentata nei macrofagi peritoneali dipendenti dalla concentrazione di GSRd, mentre l'attività della via Akt/mTOR è stata inibita dal trattamento con MK2206 (inibitore dell'AKT).Pertanto, l'evidenza supporta la tesi secondo cui GSRd converte il fenotipo dei sottoinsiemi Mos/Mps tramite l'attività Akt/mTOR dopo MI.Questo studio ha scoperto che il trattamento con GSRd ha migliorato la funzione miocardica del topo, ha attenuato la fibrosi cardiaca e ha inibito l'infiammazione e l'apoptosi nei tessuti del miocardio dopo un infarto miocardico.Dopo il trattamento di GSRd, l'aumento del Ly6Clow Mos/Mps non classico e la riduzione del Ly6Chigh Mos/Mps classico nel tessuto miocardico dopo infarto del miocardio, e il fenotipo del tessuto Mos/Mps è stato trasformato in una fase di regressione.Inoltre, studi in vitro hanno confermato che GSRd ha un effetto regolatorio simile sulla differenziazione monociti/macrofagi, che può essere correlato alla via AKT/mTOR.Come mostrato nella Figura 7A, manifestazioni patologiche di MI;Come mostrato nella Figura 7B, il meccanismo farmacologico dell'azione GSRd sui macrofagi è correlato alla via Akt/mTOR.Figura 7 Manifestazioni patologiche del MI e possibili meccanismi di intervento del GSRd.(A) Manifestazioni patologiche di MI.Tutti i diritti riservati.